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Volver a Revistas » International Journal of Nanomedicine » Volumen 17

Autores: Zhou J, Xiang H, Huang J, Zhong Y, Zhu X, Xu J, Lu Q, Gao B, Zhang H, Yang R, Luo Y, Yan F

Recibido el 28 de febrero de 2022

Aceptado para su publicación el 27 de noviembre de 2022

Publicado el 5 de diciembre de 2022 Volumen 2022:17 Páginas 5933—5946

DOI https://doi.org/10.2147/IJN.S364381

Revisión por revisión por pares anónimos únicos

Editor que aprobó la publicación: Dr. Ebrahim Mostafavi

Jie Zhou,1,2 Hongjin Xiang,1,2 Jianbo Huang,1,2 Yi Zhong,3 Xiaoxia Zhu,1,2 Jinshun Xu,1,2 Qiang Lu,1,2 Binyang Gao,1,2 Huan Zhang,1 ,2 Rui Yang,1,2 Yan Luo,1,2 Feng Yan1,2 1 Departamento de Ultrasonido, Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan, Chengdu, República Popular de China;2Laboratorio de Imágenes por Ultrasonido, Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan, Chengdu, República Popular de China;3Laboratorio de Mitocondrias y Metabolismo, Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan, Chengdu, República Popular de China Correspondencia: Feng Yan, Laboratorio de Imágenes por Ultrasonido, Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan, Chengdu, República Popular de China, Tel/Fax +86 028 8516 4146, Correo electrónico [email protected] Yan Luo, Departamento de Ultrasonido, Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan, Chengdu, República Popular de China, Tel/Fax +86 028 8542 3192, Correo electrónico [email protected] Propósito: Preparar agentes de contraste de ultrasonido a nanoescala ( Nano-UCA) y examinar el papel de su carga superficial en la activación y fagocitosis del complemento.Materiales y métodos: analizamos las proteínas séricas presentes en la corona formada en Nano-UCA y evaluamos dos importantes marcadores proteicos de activación del complemento (C3 y SC5b-9).El efecto de la carga superficial sobre la fagocitosis se evaluó adicionalmente usando macrófagos THP-1.Resultados: Cuando los Nano-UCA se incubaron con suero humano, fueron opsonizados por varias proteínas sanguíneas, especialmente C3.Los nano-UCA altamente cargados, ya sean positivos o negativos, fueron opsonizados favorablemente por las proteínas del complemento y fagocitados por los macrófagos.Conclusión: los nano-UCA cargados muestran una mayor tendencia a activar el sistema del complemento y son engullidos de manera eficiente por los macrófagos.Los presentes resultados brindan información significativa sobre el papel de la carga superficial de las nanopartículas en la activación del sistema inmunitario innato, que es importante no solo para el diseño de Nano-UCA específicos, sino también para la eficacia y seguridad de otros agentes teranósticos.Resumen gráfico: palabras clave: agentes de contraste de ultrasonido a nanoescala, carga superficial, proteína corona, activación del complemento, opsonización, fagocitosis

Los agentes de contraste de ultrasonido (UCA) son generalmente microburbujas llenas de gas (MB) con un diámetro de 1 a 8 μm, que pueden oscilar al interactuar con la onda de ultrasonido, mejorando así la señal de ultrasonido reflejada, y se han utilizado en imágenes clínicas durante décadas. 1–3 Los MB tradicionales son lo suficientemente pequeños para circular libremente en los capilares, pero demasiado grandes para extravasarse de los vasos sanguíneos y administrar fármacos al tejido.En los últimos años, los agentes de contraste de ultrasonido a nanoescala (Nano-UCA) han surgido como un sistema eficaz de administración de fármacos para la imagenología molecular y la terapia dirigida, debido a sus propiedades de respuesta a estímulos externos.4,5 Con un tamaño de cientos de nanómetros, los Nano- Los UCA pueden extravasarse de los vasos sanguíneos y acumularse en el tejido tumoral a través de la permeabilidad mejorada y el efecto de retención.6 La mayoría de los Nano-UCA tienen un núcleo de perfluorocarbono líquido y una cubierta de fosfolípidos, capaces de experimentar una transición de fase líquida a gaseosa.7,8 Los UCA tienen muchos usos potenciales, cubriendo un amplio espectro de investigación biomédica que puede traducirse en futuras aplicaciones teranósticas, como imágenes moleculares,9,10 terapia guiada por imágenes,11 fármacos mediados por ultrasonido y administración de genes,12,13 inmunoterapia,14,15 y biosensores.16 Se han desarrollado numerosos diseños de UCA, incluidos liposomas ecogénicos,17 nanogotas o nanoemulsiones,18 micelas,19 y nanoburbujas llenas de gas.20 El componente químicoLa posición de estas nanopartículas se puede ajustar de acuerdo con las propiedades fisicoquímicas y biológicas del compuesto activo y su aplicación prevista.La capa exterior de los Nano-UCA suele estar compuesta por diferentes moléculas aniónicas, catiónicas y neutras (fosfolípidos, polímeros, tensioactivos, etc.).Los UCA aniónicos generalmente se usan para administrar medicamentos contra el cáncer (p. ej., doxorrubicina, paclitaxel, etc.). la estabilidad de las nanopartículas (NP) in vitro, sino también para su vida media en sangre in vivo.La carga superficial de las NP se caracteriza generalmente a través del potencial zeta, que es exhibido por cualquier partícula en suspensión, así como macromoléculas y superficies materiales.24 La medición del potencial zeta es una técnica estándar para evaluar la carga superficial de las NP y predecir su estabilidad in vitro.25 Sin embargo, pocos estudios han reportado el papel de la carga superficial o potencial zeta de las NP en el sistema inmune innato.

El sistema inmunitario innato, incluida la red del complemento y el sistema fagocítico mononuclear (MPS), es la primera línea de defensa contra la invasión de virus, bacterias y sustancias extrañas como micro y nanopartículas.26 Después de la administración intravenosa, las NP se rápidamente cubierto por proteínas de la sangre (opsoninas) para formar una "corona de proteínas", en un proceso denominado opsonización.Este proceso ayuda a las células inmunitarias a reconocer las NP.La proteína del complemento 3 (C3) está en el centro de la reacción ligada a la enzima del complemento, que involucra todas las vías de activación del complemento.Al activarse, C3 produce opsoninas importantes, como C3b y sus fragmentos (iC3b y C3dg)27. Los fagocitos (ya sean neutrófilos o macrófagos) pueden reconocer las NP marcadas con opsoninas a través de sus receptores en la superficie celular y eliminarlas del torrente sanguíneo28.

La composición de la corona proteica depende de la superficie y las propiedades fisicoquímicas de las NP.29 Estudios previos han evaluado las interacciones de proteínas plasmáticas o séricas con varias NP, por ejemplo, nanotubos de carbono,30,31 micelas,32 liposomas,33 nanoesferas poliméricas ,34,35 óxido de hierro,36 y NP de oro.37 Hasta donde sabemos, no se han publicado estudios sistemáticos de la opsonización y activación del sistema del complemento inducida por UCA (microburbujas, nanoemulsiones o nanogotas).La cubierta de los UCA generalmente está compuesta por una monocapa delgada y blanda de fosfolípidos y polímeros derivados de lípidos.38,39 El núcleo gaseoso o líquido dota a los UCA de una alta fluidez y deformabilidad, lo que los hace muy diferentes de otros tipos de NP con poca o ninguna capacidad. deformabilidad.

Identificar los materiales que se utilizan para preparar Nano-UCA y comprender su interacción con el sistema inmunitario son la clave para su traducción clínica exitosa.Es bien sabido que el tamaño, la forma, la hidrofobicidad y el recubrimiento de polietilenglicol (PEG) de las NP son factores importantes que afectan sus interacciones con el sistema inmunitario.40–42 Sin embargo, se sabe poco sobre el papel de la carga superficial de Nano -UCAs en estas interacciones.En este estudio, investigamos el papel de la carga superficial de los Nano-UCA en la opsonización, la activación del complemento y la fagocitosis.El proceso de activación del complemento se evaluó identificando la composición de la proteína corona de los Nano-UCA y cuantificando la producción de C3 activado y el complejo del complemento terminal SC5b-9.La interacción de los Nano-UCA con las células inmunitarias se investigó observando la fagocitosis de las NP utilizando macrófagos THP-1 activados.Se espera que los resultados del presente estudio proporcionen información útil para comprender el papel de los agentes de contraste de ultrasonido a nanoescala en la respuesta inmune.

Todos los participantes dieron su consentimiento informado y el estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan (No. 2021889).El estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki.Se recolectaron muestras de sangre completa de la vena cubital mediana de donantes de sangre sanos en el Departamento de Imágenes por Ultrasonido, Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan.Las muestras se coagularon a temperatura ambiente durante 2 hy luego se centrifugaron a 2000 g durante 20 min para separar el suero.

El fosfolípido neutro 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC, S01004 AVT Pharmaceutical Co., Ltd, Shanghái, China) se utilizó como componente principal de la cubierta de Nano-UCA.Para preparar Nano-UCA neutros (Neu), una cantidad de 5% molar de 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi (polietilenglicol)-2000] (DSPE-mPEG2000, F01008 AVT Pharmaceutical Co ., Ltd) se agregó a DPPC para evitar la agregación in vitro y también proporcionar propiedades ocultas a los Nano-UCA.Para preparar Nano-UCA con una cubierta cargada, el lípido cargado negativamente 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-l-serina (DPPS, S04002 AVT Pharmaceutical Co., Ltd) o el colesterilo cargado positivamente 3β- La molécula de clorhidrato de carbamato de N-(dimetilaminoetilo) (DC-CHOL, O02003 AVT Pharmaceutical Co., Ltd) se añadió además a los Nano-UCA neutros.La composición y la nomenclatura de las diferentes formulaciones utilizadas en este estudio se muestran en la Tabla 1. Los nano-UCA se sintetizaron utilizando un método de hidratación de película delgada, como se describe a continuación.Las materias primas requeridas se pesaron y mezclaron de acuerdo con el % molar de la Tabla 1, luego se disolvieron en cloroformo a 5 mg/mL utilizando un matraz de fondo redondo.El solvente se evaporó al vacío en un evaporador rotatorio a 50 ℃ hasta que se formó y se secó una película lipídica delgada y homogénea.Se añadió solución salina estéril a la película lipídica (1 mg/mL) y la mezcla se dispersó a 50 ℃ usando un limpiador ultrasónico (SB-3200-DTD, Scientz Biotechnology Co., Ltd, Ningbo, China).Luego, cinco mililitros de la suspensión obtenida se colocaron en un baño de hielo durante 5 min y se mezclaron con 1 mL de perfluorohexano (C6F14, Strem Chemicals, Inc., Newburyport, EE. UU.).La mezcla se sonicó con un instrumento de oscilación ultrasónica (SCIENTZ-IID, Scientz Biotechnology Co., Ltd) durante 5 min a 300 W y un ciclo de trabajo del 50 % para generar las nanopartículas.La suspensión de NP se extruyó a través de una membrana de policarbonato (PCTE) (tamaño de filtro 0,8 µm, ϕ = 19,05 mm, 100/PK, SterliTech CO, Washington, EE. UU.) utilizando una extrusora manual (Genizer LLC, California, EE. UU.).La suspensión resultante de Nano-UCA se almacenó a 4 ℃ hasta su uso.Se obtuvieron imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) para inspeccionar la forma de los Nano-UCA (microscopio electrónico Tecnai G2 F20 S-TWIN, FEI, Inc., Hillsboro, EE. UU.).El tamaño de las NP y el potencial zeta se midieron con un analizador NanoBrook 90plus PALS (Brookhaven, Inc., Nueva York, EE. UU.).La concentración de NP se midió con un instrumento ZetaView (Particle Metrix, Kassel, Alemania) y luego se ajustó a 1 × 1012 o 1 × 1010 partículas/mL para experimentos posteriores.Tabla 1 Composición y nomenclatura de nano-UCA con diferente carga superficial

Tabla 1 Composición y nomenclatura de nano-UCA con diferente carga superficial

El sistema de ensayo se basa en los métodos de Chen F y Vu Vivian P.36,43 Se mezcló una concentración de 1 × 1012 partículas/mL de Neu Nano-UCA en solución salina con muestras de suero obtenidas de tres donantes de sangre en una proporción de volumen de 1:3. (v/v).Al final de la incubación (37 ℃, 1 h), las nanopartículas se recuperaron y lavaron tres veces mediante centrifugación a 100 000 g en solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con Ca2+/Mg2+ durante 5 min utilizando una ultracentrífuga Beckman Optima TLX.Los sedimentos depositados en el suero se lavaron con 100 μL de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 2% durante 1 h a temperatura ambiente para extraer las proteínas que forman la corona.El sobrenadante de proteína se recuperó mediante ultracentrifugación adicional y se almacenó en alícuotas congeladas a -80 ℃ hasta su uso.

Las proteínas adsorbidas recuperadas de la superficie de los Neu Nano-UCA se mezclaron con un tampón de carga de muestra no reductor (P0016N, tampón de carga de muestra de gel nativo, 5X, Beyotime Biotechnology, Shanghái, China) y se cargaron (20 μL por carril) en 4 % de apilamiento de geles de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida.Luego se realizó la electroforesis (70 V durante 20 min);las tiras de gel resultantes de proteínas enteras se cortaron cuidadosamente usando una cuchilla quirúrgica desechable.Dentro de las tiras de gel, las proteínas se deshidrataron con acetonitrilo (ACN), se redujeron, se alquilaron con ditiotreitol y yodoacetamida y luego se digirieron en péptidos con tripsina.Los péptidos (8 μg) se resolubilizaron en ácido fórmico (AF) al 0,1 % y se analizaron con un EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, EE. UU.) con un sistema de espectrómetro de masas Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (Thermo) en datos. modo de adquisición dependiente (DDA).La columna de separación (75 μm × 15 cm, columna C18 empaquetada con 3,0 μm de partículas C18) se usó con un caudal de 300 nL/min utilizando 0,1 % de FA (disolvente A) y 80 % de ACN más 0,1 % de FA (disolvente B) con un gradiente de 78 min.El gradiente de separación de LC fue del 5 al 8 % de disolvente B durante 8 min, del 8 al 22 % de disolvente B durante 50 min, del 22 al 32 % de disolvente B durante 12 min, del 32 al 90 % de disolvente B durante 1 min y del 90 % de disolvente B durante los últimos 7 min.Los ajustes de la fuente de iones, incluido el voltaje de pulverización, el gas de barrido y la temperatura del tubo de transferencia de iones, se obtuvieron a partir de los ajustes de sintonización y se ajustaron a los estados actuales del instrumento.Para los escaneos MS1, la masa varió de m/z 350 a 1550 con una resolución de 60 000 (a m/z 200), un valor objetivo de control automático de ganancia (AGC) fue 1 × 106, un tiempo máximo de inyección fue 50 ms, los iones precursores de mayor intensidad fueron para el análisis MS2 en 3 segundos, la abundancia mínima de iones precursores es 50 000 y la ventana aislada es 2. Para el escaneo MS2, la energía de colisión HCD normalizada fue 35 %, la resolución fue 15 000 (a m /z 200), el valor objetivo de AGC se estableció en 5 × 104 y el tiempo máximo de inyección fue de 80 ms.La lente RF fue del 30% y los espectros se recogieron en modo perfil (MS1) y en modo centroide (MS2).Los análisis cualitativos y cuantitativos de los espectros de MS se realizaron utilizando el software Maxquant y la plataforma "Wu Kong" (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).

Para estudiar la unión de C3 activado a Nano-UCAs con diferentes cargas superficiales, se mezclaron 1×1012 partículas/mL de Nano-UCAs neutros y cargados con muestras de suero humano en proporción 1:3 (v/v) para preparar el sobrenadante de proteínas.Para cada muestra, se mezclaron alícuotas de 20 μL con tampón de carga de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio no reductor (SDS-PAGE) y se hirvieron durante 5 min.Las proteínas hervidas se separaron electroforéticamente mediante gel Tris-Gly al 8 % y se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF).La membrana se bloqueó usando leche descremada en polvo al 5 % (p/p) en PBS 1x con Tween-20 al 0,1 % (PBS-T) durante 1 h a temperatura ambiente y se sondeó con los anticuerpos primarios correspondientes (anticuerpo monoclonal de ratón producido contra factor C3 del complemento humano activado, I3/15 sc-47687, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, EE. T).Finalmente, las muestras resultantes se incubaron durante 1 h con los correspondientes anticuerpos secundarios contra la especie de anticuerpo primario (Mouse IgGκ light chain binding protein conjugated to horseradish peroxidase (HRP), sc-516102, Santa Cruz).Las señales de la banda de proteína en la membrana de PVDF se visualizaron utilizando un generador de imágenes de quimioluminiscencia (ChemiDoc™ MP, Bio-Rad System, Inc., Hercules, EE. UU.).

Antes y después de la incubación con Nano-UCA, se analizó el suero para determinar los niveles de SC5b-9 utilizando un kit de ensayo de adsorción inmune ligado a enzimas (ELISA) (MicroVue SC5b-9 Plus EIA, Quidel Corporation, San Diego, EE. UU.).Para cuantificar los niveles de SC5b-9, utilizamos estándares de la serie SC5b-9 con concentraciones de 10, 40, 110 y 170 ng/mL, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Se agregaron estándares y muestras a pocillos de microensayo recubiertos previamente con anticuerpo monoclonal específico anti-SC5b-9.Después de 1 h de incubación, se realizó un ciclo de lavado para eliminar los materiales no unidos.Se añadieron a cada pocillo anticuerpos conjugados con HRP contra antígenos en SC5b-9.A continuación, la incubación con anticuerpos conjugados con HRP durante 30 min fue seguida por otro ciclo de lavado.Finalmente, se añadió a cada pocillo un sustrato de enzima cromogénica.Después de reaccionar con los anticuerpos conjugados con HRP unidos, el sustrato se volvió azul.Luego se agregó un reactivo para detener el desarrollo del color, lo que resultó en un color amarillo.Los valores de absorbancia estándar y de muestra (A450) se midieron mediante un lector de microplacas (Synergy HT, Bio-Tek, Vermont, EE. UU.).El análisis cuantitativo de las muestras se realizó interpolando los resultados del A450 utilizando la ecuación de regresión lineal de la curva estándar.

Células THP-1 pro-monocíticas humanas (CC1904, CellCook Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China) y células de cáncer de pulmón de células no pequeñas humanas NCI-H1299 (CC0203, CellCook Biotechnology Co., Ltd.) se cultivaron de forma rutinaria en Medio RPMI 1640 (22,400–089, Gibco, Karlsruhe, Alemania), que contiene 10 % (v/v) de suero de ternera fetal inactivado por calor (10,100–147, Gibco) complementado con 10,000 unidades/ml de penicilina y 10,000 unidades/ml de estreptomicina ( 15, 140–122, Gibco).Las células se mantuvieron a 37 ℃ en una atmósfera humidificada de 95 % de aire y 5 % de CO2.

Para evaluar la captación de Nano-UCA por parte de los macrófagos, se sembraron células THP-1 en placas de 6 pocillos de 35 mm a una densidad de 1 × 106 células/pocillo en presencia de acetato de miristato de forbol 100 nM (PMA, P1585, Sigma, St. Louis, EE. UU.) y se dejó adherir a las placas durante 48 h.Después de la adición de PMA, las células THP-1 diferenciadas se incubaron con 1 × 1010 partículas/ml de nano-UCA marcados con perclorato de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametil-indocarbocianina (DiI) (C1036 , Beyotime Biotechnology) a temperatura ambiente durante 1 h.Después de la tinción de fluorescencia lisosomal (C1046, Lyso-tracker red, Beyotime Biotechnology) y fluorescencia del núcleo (C1022, Hoechst 33,342 blue, Beyotime Biotechnology), las células se fijaron y visualizaron mediante microscopía de fluorescencia confocal láser (LCFM, A1R-MP, Nikon, Tokio , Japón).Para el análisis cuantitativo, después de la incubación con Nano-UCA marcados con DiI, las células THP-1 se separaron con tripsina EDTA, se recolectaron y analizaron usando un citómetro de flujo (FACS Caliburl, BD Biosciences, Franklin Lake, EE. UU.).Los Nano-UCA marcados también se incubaron con células NCI-H1299 no fagocíticas y se observaron usando LCFM, como se describe anteriormente.

Los datos se analizaron utilizando GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, CA, EE. UU.).Las diferencias se evaluaron mediante el análisis de varianza unidireccional seguido de la prueba post-hoc de Newman-Keuls para comparaciones de grupos múltiples y la prueba t de Student para comparaciones entre dos grupos.Todos los datos cuantitativos que se muestran en las figuras se presentan como media ± desviación estándar (DE).

En este estudio, preparamos siete formulaciones de Nano-UCA.En particular, se prepararon Nano-UCA con carga positiva y negativa agregando diferentes proporciones molares de moléculas aniónicas o catiónicas a las muestras de Neu Nano-UCA (Tabla 1);la síntesis se ilustra en la Figura 1A.Para evaluar el papel de la carga superficial en la activación del complemento, el tamaño de partícula y la distribución correspondiente se mantuvieron lo más constante posible para todas las formulaciones.Las imágenes de TEM en la Figura 1B muestran que las partículas de Nano-UCA eran casi esféricas y tenían un tamaño de aproximadamente 500 a 600 nm, con una superficie suave y lisa.El tamaño de partícula, el índice de polidispersión (PDI) y el potencial zeta de diferentes formulaciones de Nano-UCA se muestran en las Figuras 1C–E, respectivamente.La única diferencia significativa entre las diferentes nanopartículas es el cambio en el potencial zeta.Para Neu Nano-UCA formulados con 95 % de DPPC + 5 % de DSPE-mPEG2000, el potencial zeta fue de −0,32 ± 1,95 mV.Cuando se añadió el fosfolípido aniónico DPPS a la formulación neutra, el potencial zeta disminuyó gradualmente de -0,32 ± 1,95 mV (0 %) a -11,29 ± 2,01 mV (25 %), -22,85 ± 10,81 mV (50 %) y - 40,95±1,16mV (75%).Por el contrario, los potenciales zeta de las formulaciones que contenían 0 %, 25 %, 50 % y 75 % de DC-CHOL aumentaron gradualmente de −0,32 ± 1,95 mV a 15,80 ± 3,18 mV, 29,16 ± 7,78 mV y 51,33 ± 2,89 mV. respectivamente.Cuando se almacenaron en solución salina a 4 ℃, todos los Nano-UCA permanecieron relativamente estables durante el período de prueba (Figura 2).Figura 1 Síntesis y caracterización de diferentes formulaciones de Nano-UCAs.(A) Representación esquemática de Nano-UCA con varias cargas superficiales.Se prepararon nano-UCA con cargas superficiales neutras, positivas y negativas con diferentes proporciones molares de DPPC (bola azul), DC-CHOL (bola rosa) y DPPS (bola verde).Se añadió DSPE-mPEG2000 (5% en moles, bola morada) a todas las formulaciones para evitar la agregación de partículas.(B) Imágenes de microscopía electrónica de transmisión de Nano-UCA con diferentes cargas superficiales.(C) Tamaño de partícula medio (nm), (D) índice de polidispersidad medio (PDI) y (E) potencial zeta medio (mV) de diferentes formulaciones de Nano-UCA.Figura 2 Estabilidad in vitro de Nano-UCAs.(A) Tamaño de partícula medio (nm), (B) índice de polidispersión medio (PDI) y (C) potencial zeta medio (mV) de diferentes formulaciones en solución salina a 1, 2, 4, 7 y 14 días.Cada punto representa la media ± SD de tres repeticiones.

Figura 1 Síntesis y caracterización de diferentes formulaciones de Nano-UCAs.(A) Representación esquemática de Nano-UCA con varias cargas superficiales.Se prepararon nano-UCA con cargas superficiales neutras, positivas y negativas con diferentes proporciones molares de DPPC (bola azul), DC-CHOL (bola rosa) y DPPS (bola verde).Se añadió DSPE-mPEG2000 (5% en moles, bola morada) a todas las formulaciones para evitar la agregación de partículas.(B) Imágenes de microscopía electrónica de transmisión de Nano-UCA con diferentes cargas superficiales.(C) Tamaño de partícula medio (nm), (D) índice de polidispersidad medio (PDI) y (E) potencial zeta medio (mV) de diferentes formulaciones de Nano-UCA.

Figura 2 Estabilidad in vitro de Nano-UCAs.(A) Tamaño de partícula medio (nm), (B) índice de polidispersión medio (PDI) y (C) potencial zeta medio (mV) de diferentes formulaciones en solución salina a 1, 2, 4, 7 y 14 días.Cada punto representa la media ± SD de tres repeticiones.

Para investigar la composición de la corona de proteínas que cubre los Neu Nano-UCA, realizamos un análisis de EM de las proteínas séricas unidas a los Nano-UCA (Figura 3A y Tabla complementaria 1).C3 se encontraba entre las proteínas más abundantes en las tres muestras de suero analizadas.Para estudiar más a fondo la influencia de la carga superficial en la opsonización, se determinó el C3 activado en la proteína corona mediante el análisis de transferencia Western (WB).La Figura 3B sugiere que el C3 activado se unió a un grupo de proteínas en lugar de a la superficie Nano-UCA sola: el C3 activado eluido de todos los Nano-UCA cargados en la superficie mostró un patrón manchado de alto peso molecular (≥270 kDa), en comparación al de C3 purificado con un peso molecular de 195 kDa.El experimento se repitió tres veces usando tres muestras de suero diferentes.Según la densidad integrada (ID) calculada a partir del valor gris (puntos por pulgada, Figura 3C) de la banda C3 WB activada por el software ImageJ (versión 1.51j8, Institutos Nacionales de Salud, EE. UU.), los Nano-UCA neutrales adsorbieron el cantidad más baja de C3 activado (836.45±320.34 ID).Los Nano-UCA con una carga más baja unieron una cantidad relativamente baja de C3 activado, con 3490,56 ± 1450,29 ID y 1481,39 ± 40,59 ID para el 25 % de Nano-UCA con carga negativa y el 25 % con carga positiva, respectivamente.Los Nano-UCA al 50 % (-) y al 50 % (+) adsorbieron una mayor cantidad de C3 activado que las muestras de menor carga, con 6072,28±1049,22 ID y 4145,03±286,69 ID para los Nano-UCA con carga negativa y positiva, respectivamente. .Los Nano-UCA de alta carga adsorbieron la mayor cantidad de C3 activado, con 19 448,67 ± 522,58 ID y 18 775,48 ± 1950,21 ID para el 75 % (-) y el 75 % (+) de Nano-UCA, respectivamente.Figura 3 Papel de la carga superficial de los agentes de contraste ultrasónicos a nanoescala en la activación del sistema del complemento y la fagocitosis.(A) Corona de proteína formada en Neu Nano-UCA: mapa de calor de las 30 proteínas principales identificadas en coronas.Las proteínas se clasifican según el logaritmo de la puntuación de confianza determinada a partir del número de péptidos y la calidad de los espectros de MS.(B) Bandas no reductoras de transferencia Western de C3 activado unidas a superficies Nano-UCA con carga diferente en muestras de suero.El experimento se repitió tres veces usando tres muestras de suero diferentes.(C) Análisis de valores grises de bandas WB de C3 activado.El experimento se repitió tres veces usando tres muestras de suero diferentes.Los datos se muestran como media ± DE (***P < 0,001).(D) Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas para la detección cuantitativa de SC5b-9 humano.El gráfico en la esquina superior derecha muestra la curva estándar de SC5b-9, y el histograma debajo muestra la cantidad de SC5b-9 producida en muestras de suero incubadas con Nano-UCA cargados de manera diferente.La columna de control muestra los niveles de SC5b-9 en suero antes de la incubación con Nano-UCA.Los datos se muestran como media ± SD de tres experimentos repetidos.(E) Efectos de la carga superficial (potencial zeta, mV) en los niveles de C3 activado (determinado por análisis de transferencia Western, azul) y SC5b-9 (determinado por ELISA, rojo) en suero después de la incubación con Nano-UCA.Para una formulación de Nano-UCA dada, cada par de datos en la figura representa una medición individual.

Figura 3 Papel de la carga superficial de los agentes de contraste ultrasónicos a nanoescala en la activación del sistema del complemento y la fagocitosis.(A) Corona de proteína formada en Neu Nano-UCA: mapa de calor de las 30 proteínas principales identificadas en coronas.Las proteínas se clasifican según el logaritmo de la puntuación de confianza determinada a partir del número de péptidos y la calidad de los espectros de MS.(B) Bandas no reductoras de transferencia Western de C3 activado unidas a superficies Nano-UCA con carga diferente en muestras de suero.El experimento se repitió tres veces usando tres muestras de suero diferentes.(C) Análisis de valores grises de bandas WB de C3 activado.El experimento se repitió tres veces usando tres muestras de suero diferentes.Los datos se muestran como media ± DE (***P < 0,001).(D) Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas para la detección cuantitativa de SC5b-9 humano.El gráfico en la esquina superior derecha muestra la curva estándar de SC5b-9, y el histograma debajo muestra la cantidad de SC5b-9 producida en muestras de suero incubadas con Nano-UCA cargados de manera diferente.La columna de control muestra los niveles de SC5b-9 en suero antes de la incubación con Nano-UCA.Los datos se muestran como media ± SD de tres experimentos repetidos.(E) Efectos de la carga superficial (potencial zeta, mV) en los niveles de C3 activado (determinado por análisis de transferencia Western, azul) y SC5b-9 (determinado por ELISA, rojo) en suero después de la incubación con Nano-UCA.Para una formulación de Nano-UCA dada, cada par de datos en la figura representa una medición individual.

Se midieron los niveles séricos de SC5b-9 para evaluar el efecto de los Nano-UCA en la activación del complemento.Para determinar la concentración de SC5b-9, se obtuvo una curva estándar usando las muestras estándar provistas con el kit SC5b-9 Plus EIA.La pendiente, la intersección y el coeficiente de correlación de la línea de mejor ajuste se encuentran dentro de los rangos especificados por el fabricante (y = 0,007466x + 0,2036, r = 0,997).La Figura 3D revela que una mayor carga superficial condujo a una mayor producción de SC5b-9 en el suero.Por ejemplo, la cantidad de SC5b-9 producida por Neu Nano-UCA fue de 19,84±4,70 µg/mL, mientras que el 25 % (-) y el 25 % (+) de Nano-UCA produjeron niveles de SC5b-9 de 30,41±25,69 y 23,27 ±8,82 µg/mL, respectivamente.Para los Nano-UCA al 50 % (-) y al 50 % (+), las cantidades producidas de SC5b-9 fueron 99,85±32,70 y 47,87±1,52 µg/mL, respectivamente.Al igual que el C3 activado unido a Nano-UCA, el 75 % (-) y el 75 % (+) de Nano-UCA produjeron las cantidades más altas de complejo SC5b-9: 152,65 ± 3,65 y 78,64 ± 27,93 µg/mL, respectivamente.Estos resultados indican una correlación significativa entre C3 activado, SC5b-9 y la carga superficial de los Nano-UCA (Figura 3E), lo que sugiere que la activación del sistema del complemento por parte de los Nano-UCA depende de su carga superficial.

Para examinar más a fondo si los Nano-UCA simplemente se adsorbieron en la superficie celular o fueron engullidos por macrófagos, las células THP-1 y NCI-H1299 se incubaron por separado con Nano-UCA marcados con DiI.Después de lavar vigorosamente las células, casi todos los Nano-UCA desaparecieron del medio de cultivo, mientras que todavía se observaron en las células THP-1 (Figura 4).Las imágenes de LCFM revelaron que los Nano-UCA se localizaron dentro de lisosomas verdes marcados con fluorescencia (Figura 4).Las Figuras 5A-D muestran la absorción de Nano-UCA con carga diferente por parte de las células THP-1.Todos los Nano-UCA cargados exhibieron una fuerte fluorescencia roja dentro de las células THP-1 (Figura 5A).El análisis de la intensidad de fluorescencia media (MFI) (Figura 5B) indicó que la absorción de Nano-UCA por las células THP-1 aumentó significativamente con el aumento de la densidad de carga superficial, especialmente para Nano-UCA con 75 % de carga positiva.Los valores de MFI de 25 % (-), 50 % (-) y 75 % (-) de Nano-UCA fueron 10,6, 11,5 y 11,9 veces más altos que los de Neu Nano-UCA, respectivamente.Además, los valores de MFI de 25 % (+), 50 % (+) y 75 % (+) de Nano-UCA fueron 9,0, 9,9 y 28,5 veces más altos que los de Neu Nano-UCA, respectivamente.Se obtuvieron resultados cuantitativos similares mediante citometría de flujo (Figuras 5C y D).Figura 4 Microscopía de barrido láser confocal de fagocitosis de Neu Nano-UCA por macrófagos THP-1.En este experimento, las nanopartículas se incubaron primero con suero de donante para producir la proteína corona y luego se incubaron con células.Las células NCI-H1299 no fagocíticas también se incubaron con el mismo suero del donante y se usaron como comparación.Se observaron Neu Nano-UCA marcados con DiI (rojo) en células THP-1 después de un lavado intensivo con PBS, pero no se detectaron en células NCI-H1299.Figura 5 Fagocitosis de Nano-UCAs con diferentes cargas superficiales por células THP-1.(A) Imágenes de microscopía de barrido láser confocal de la captación celular de Nano-UCA después de la incubación del suero para generar corona de proteínas.Los lisosomas de células THP-1, núcleos celulares y Nano-UCA se marcaron con tinte fluorescente verde, azul y rojo, respectivamente.Todos los Nano-UCA se incubaron con células THP-1 durante 1 hora.Barra de escala = 10 mm.(B) Cuantificación de la captación de células en función de los valores de MFI de cada célula obtenidos a partir de microscopía de barrido láser confocal.(C) Captación celular de Nano-UCA determinada por citometría de flujo.(D) Captación celular cuantitativa de Nano-UCA con diferentes cargas superficiales, obtenida por citometría de flujo.

Figura 4 Microscopía de barrido láser confocal de fagocitosis de Neu Nano-UCA por macrófagos THP-1.En este experimento, las nanopartículas se incubaron primero con suero de donante para producir la proteína corona y luego se incubaron con células.Las células NCI-H1299 no fagocíticas también se incubaron con el mismo suero del donante y se usaron como comparación.Se observaron Neu Nano-UCA marcados con DiI (rojo) en células THP-1 después de un lavado intensivo con PBS, pero no se detectaron en células NCI-H1299.

Figura 5 Fagocitosis de Nano-UCAs con diferentes cargas superficiales por células THP-1.(A) Imágenes de microscopía de barrido láser confocal de la captación celular de Nano-UCA después de la incubación del suero para generar corona de proteínas.Los lisosomas de células THP-1, núcleos celulares y Nano-UCA se marcaron con tinte fluorescente verde, azul y rojo, respectivamente.Todos los Nano-UCA se incubaron con células THP-1 durante 1 hora.Barra de escala = 10 mm.(B) Cuantificación de la captación de células en función de los valores de MFI de cada célula obtenidos a partir de microscopía de barrido láser confocal.(C) Captación celular de Nano-UCA determinada por citometría de flujo.(D) Captación celular cuantitativa de Nano-UCA con diferentes cargas superficiales, obtenida por citometría de flujo.

Las NP tienen un gran potencial para su aplicación en la nanomedicina; sin embargo, su capacidad para dirigirse a los tejidos enfermos aún se desconoce en gran medida, y se encontró que solo el 0,7 % (mediana) de la dosis de NP administrada se administra a los tumores sólidos.44 Una de las causas directas de esto la baja eficiencia es que las NP son eliminadas rápidamente por el sistema inmunitario innato.45,46

Se ha sugerido que la opsonización de las proteínas de la sangre y la captación por las MPS son los principales mecanismos para la rápida eliminación de los liposomas de la sangre, lo que afecta su vida útil.47,48 La capa externa de los liposomas es similar a la de los MB y Nano- UCA, constituidos por fosfolípidos neutros y/o cargados.Klapper et al encontraron que los liposomas neutros elaborados con el fosfolípido dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) incubados en plasma conducían a la generación de productos de activación del complemento (C3a y SC5b-9).49 Van den Hoven et al informaron que los liposomas vacíos que contenían 5% mol de DSPE -PEG2000 no indujo significativamente la activación del complemento (C3, SC5b-9)50. Chonn et al realizaron un estudio en profundidad sobre el efecto de la carga superficial de los liposomas en la activación del complemento.Utilizaron muestras de suero obtenidas de seres humanos sanos o cobayos incubados con liposomas, y luego determinaron la actividad hemolítica residual del suero como medida de la activación del complemento.Descubrieron que la carga superficial de los liposomas era un factor clave en la activación del complemento independientemente del tipo de carga superficial.51

El sistema inmunitario innato interactúa no solo con los liposomas, sino también con todas las nanopartículas y micropartículas.Lundqvist et al utilizaron NP de poliestireno recubiertas con diferentes polímeros para realizar una evaluación sistemática de los efectos de la carga superficial y el tamaño de las NP en la corona proteica.29 Descubrieron que tanto el tamaño como la carga superficial desempeñaban un papel importante en la formación de la corona. de NP.También demostraron que la mayoría de las proteínas implicadas en la vía del complemento, como C3 y el factor H del complemento, pueden adsorberse en la superficie de las NP neutras.Nuestro análisis proteómico mostró que los Neu Nano-UCA de 600 nm incubados con suero humano adsorbieron más de 30 proteínas en su superficie (Figura 3A y Tabla complementaria 1).Entre estas proteínas, C3 exhibió el contenido más alto y se unió a otras proteínas (formando un grupo) en lugar de a la superficie nativa de la nanopartícula (Figura 3B), como también se informó en otros estudios.43 Usando nanogusanos de óxido de hierro recubiertos con dextrano incubados en suero y plasma humano, Chen et al revelaron que los nanogusanos fueron opsonizados rápidamente por C3 a través de la vía alternativa del sistema del complemento. utilizados en el presente estudio son muy diferentes de los considerados por Chen et al en términos de tamaño, forma, recubrimiento superficial y material del núcleo, su unión a C3 fue bastante similar.Aunque todos nuestros Nano-UCA contenían 5 mol % de DSPE-PEG2000, la PEGilación no evitó la formación de corona proteica ni la activación del complemento.

Las microburbujas de SonazoidTM recubiertas con fosfatidilserina de huevo hidrogenado (HEPS) con fosfolípido cargado negativamente al 100 % son captadas preferentemente por las células de Kupffer en el hígado,52 proporcionando una imagen de contraste específica del parénquima denominada imagen de fase de Kupffer.53 Sin embargo, el mecanismo exacto por el cual las microburbujas de SonazoidTM son específicamente acumulado en las células de Kupffer aún no está claro.Solo un estudio previo investigó el papel de la carga superficial de MB en las imágenes de ultrasonido con contraste.54 Algunos agentes de microburbujas se adhieren a los leucocitos activados en las vénulas poscapilares a través de la integrina de la superficie celular o la opsonización de los componentes del complemento, lo que da como resultado un aumento de contraste miocárdico persistente en áreas de tejido. inflamación.54 Además, Fisher et al. demostraron que las microburbujas cargadas negativamente (2-3 μm) inducían la retención capilar, y sugirieron que esta retención estaba mediada por la unión de C3b activado a la superficie de las MB.55 Usaron citometría de flujo para analizar la complemento se unió a la superficie de los MB y descubrió que C3b se unía principalmente a los MB aniónicos, pero mostraba una adsorción mucho menor en la superficie de los MB neutros que contenían estearato de PEG-40.Nuestro estudio sugiere además que, independientemente de su carga, todos los Nano-UCA podrían inducir la activación del complemento;una mayor carga superficial condujo a mayores cantidades de unión de C3 activado a NP (Figura 3C) y de SC5b-9 producido en suero (Figura 3D).La Figura 3E resume los hallazgos anteriores: la carga superficial (o el valor de potencial zeta absoluto) de los Nano-UCA desempeña un papel importante en la opsonización (C3 activado) y la activación del complemento (SC5b-9).

Después de la activación del complemento, las células inmunitarias eliminan los Nano-UCA in vivo.La unión del componente del complemento C3b a la superficie de las NP conduce a la fagocitosis, debido a la presencia de receptores del complemento en las células fagocíticas.56,57 Como se muestra en la Figura 3E, en comparación con los Neu Nano-UCA, los Nano-UCA cargados se adsorbieron o activó las cantidades más altas de C3 y SC5b-9, lo que llevó a que los macrófagos los absorbieran eficientemente (Figura 5A).Este hallazgo puede explicar en parte el mecanismo de la imagen de fase de Kupffer específica de las microburbujas SonazoidTM.

La opsonización de las NP es un paso clave en la activación del complemento, el reconocimiento de fagocitos y la eliminación de la circulación sanguínea.La mayoría de los intentos de evitar o reducir la unión de las opsoninas se han centrado en la preparación de NP sigilosas.Se han explorado varias estrategias, incluido el uso de NP inorgánicas más pequeñas,58 microesferas que imitan células (recubriendo las partículas con membranas de células sanguíneas),59,60 preparar partículas con biomoléculas naturales,61 controlar los componentes de la corona de proteínas,62 usar vesículas celulares como transportadores de fármacos, 63 o combinar portadores de fármacos con moléculas de histocompatibilidad.64 Desafortunadamente, muchos de estos enfoques a menudo ignoran el papel de la carga superficial de las nanopartículas en el sistema inmunitario innato, a pesar de su importancia para la seguridad clínica y la eficacia de los nanomedicamentos.

Estudios recientes demostraron que la baja eficiencia de direccionamiento de las NP a los sitios tumorales (0,7–2,2 %) dificulta gravemente su aplicación clínica en el tratamiento del cáncer.44,65 Los posibles efectos tóxicos, como las reacciones anafilactoides asociadas con los Nano-UCA cargados, son otro tema importante. afectando su traducción clínica, como ya se informó para los liposomas y otros tipos de nanomedicamentos.50 Estos aspectos deben considerarse cuidadosamente en los diseños de formulación futuros.

En este estudio, sintetizamos Nano-UCA con diferentes cargas superficiales.Nuestros resultados muestran que la carga superficial juega un papel importante en la opsonización y activación del complemento.Los Nano-UCA cargados muestran una mayor tendencia a interactuar con C3 y producen más SC5b-9 en comparación con los Nano-UCA neutros.Además, los nano-UCA cargados son absorbidos eficientemente por los macrófagos.Estos resultados nos permiten identificar la composición de la corona de los Nano-UCA y demostrar la importancia de la carga superficial en la activación del complemento y la captación de Nano-UCA por parte de los macrófagos.

Agradezca a Yi Zhong, Tao Su y Shisheng Wang (West China-Washington Mitochondria and Metabolism Research Center, West China Hospital, Sichuan University) por la adquisición y el análisis de datos relativos a la EM.

Los autores no reportan conflictos de intereses en este trabajo.

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